细胞内的物质运输系统实验步骤之霍乱毒素次单元B的运输!
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细胞内的物质运输系统实验步骤之!
（二）蛋白质内胞作用一：霍乱毒素次单元B （Cholera Toxin subunit-B；CTB-594 nm；红光）之运输
1. 取4×104个COS-7细胞至12-well plate的单一培养井（well）中，经隔夜培养约16~24小时。
2. 取出培养液，加入含有萤光标定的CTB，浓度为1μg/μl，体积200μl至每一个培养井内，并置入摄氏4度的冰箱10分钟。
3. 将细胞自冰箱取出，立刻放入二氧化碳培养箱，温度摄氏37度，二氧化碳浓度5 %，30分钟，促使 CTB 能从细胞膜运送至高基氏体处。
4. 取出后，以PBS清洗一次，再以浓度4 % 的福马林进行固定15分钟。
5. 以 PBS 清洗一次，加入含有0.01 % Triton X-100、0.05 % SDS的清洁剂，静置15分钟，以增加细胞膜的通透性。
6. 以 PBS 清洗二次，加入含有皂素（saponin）、牛血清白蛋白质（Bovine Serum Albumin；BSA）的阻断缓衝液，静置30分钟，以阻断抗原与抗体间非专一性的结合。
7. 取出阻断缓衝液后，加入含有抗高基氏体标示蛋白质Golgin-245的抗体（来自老鼠的单株抗体；一级抗体），静置30分钟。
8. 以 PBS 清洗四次，加入含有萤光标定的二级抗体（抗老鼠之免疫球蛋白；绿光），以及 DNA 染剂 Hochest33258，静置30分钟。
9. 以 PBS 清洗四次，待自然风乾后，于载玻片上滴入封片液，进行封片。
10. 以萤光显微镜观察标示蛋白质在细胞内的分布情形。
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