细胞内的物质运输系统实验步骤之细胞转染！
信息分类：生命科学资讯 作者:YIYI发布
细胞内的物质运输系统实验步骤之细胞转染！
细胞转染（transfection）暨蛋白质外释作用：VSVG-GFP与ARLI-QL质体（plasmid）共同转染
1. 取4×104个COS-7细胞至12-well plate的单一培养井（well）中，经隔夜培养约16~24小时。
2. 取100μl OPTI-MEN（ㄧ种不含胎牛血清的培养液）及0.5μg ARL1QL质体、0.5μg VSVG-GFP质体混合，取100μl OPTI-MEN 及1μl lipofectamin（ㄧ种脂小体）混合，将二者均匀混合，静置30分钟。
3. 取出原培养液，并加入100μl OPTI-MEN至每一个培养井后，将含有ARL1QL、VSVG-GFP及脂小体的混合液加入培养井，放入二氧化碳培养箱5小时。
4. 抽出混合液，更换正常之培养液（含10% FBS(胎牛血清)/DMEM），继续培养36-48小时。
5. 取出细胞培养盘后，以 PBS 清洗一次，再以浓度4 % 的福马林进行固定15分钟。
6. 以PBS清洗一次，加入含有0.01 % Triton X-100、0.05 % SDS的清洁剂，静置15分钟，以增加细胞膜的通透性。
7. 以PBS清洗二次，加入含有saponin、BSA的阻断缓衝液，静置30分钟，以阻断抗原与抗体间非专一性的结合。
8. 取出阻断缓衝液后，加入抗ARL1的抗体（来自兔子的多株抗体；一级抗体），静置30分钟。
9. 以 PBS 清洗四次，加入含有萤光标定的二级抗体（抗兔子之免疫球蛋白，来自山羊；红光），以及 DNA 染剂 Hochest33258，静置30分钟。
10. 以PBS清洗四次，待自然风乾后，于载玻片上滴入封片液，进行封片。
11. 以萤光显微镜观察标示蛋白质在细胞内的分布情形。
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