PAP包埋前染色的操作步骤和PAP法包埋后染色
信息分类：生命科学资讯 作者:YIYI发布
PAP包埋前染色的操作步骤和PAP法包埋后染色
PAP法常用包埋前染色，现以超氧化物歧化酶为例，说明具体
的操作步骤。
(l)固定组织恒冷箱冰冻切片10um用于光镜，振动切片或手切
薄片等用于电镜。
(2)切片经PBS(pH7.4)漂洗。
(3)0.3%H2O2甲醇溶液室温10-30min以封闭内源性过氧化物酶。
(4)0.25%tritonX一100处理10min。
(5)正常羊血清(1:30 PBS稀释)室温30min。，吸干。
(6)第一抗体(免抗SOD血清，l:2000)4℃湿盒中48-72h。
(7)0.lmol/L PBS漂洗(3X5min)。
(8)羊抗免一lgG(l:30-50)室温30-60min。
(9)0.lmol/PBS漂洗(3X5min)。
(10)免PAP复合物(1:100)室温30-60min。一抗、二抗和PAP的合
适稀释度要通过预试验来确定。
(11)0.lmol/L PBS漂洗(3X5min)
(12)用含0.05%二氨基联苯胺(DAB)和0.01%H2O2的混
合液(用0.05mol/LTris-HCI缓冲液PH7.4配制)室温15min。显
色。镜下控制反应强度，适时终止显色。
(13)0.lmol/L PBS漂洗(3X5min)，光镜观察。
(14)电镜研究时，用4%戊二醛再固定60min，PBS漂洗、解
剖镜下检出免疫阳性部位.修整切片，用1%锇酸后固定30-
6Omin.若用1.5%亚铁氰化钾一l%锇酸后固定，这样可不进行电
子染色，直接电镜包埋、切片和观察。
(15)对照:①用正常兔血清代抗S0D血清作对照:②不加
抗SOD血清的空白对照;③吸附试验，用SOD吸附抗SOD血清。
以上三种对照均为阴性。
PAP法包埋后染色
(l)固定组织按常规电镜包埋、切片。
(2)将载有切片的镍网在5%的H2O2液中刻蚀2-3min。，生
理盐水冲洗，滤纸吸干。其余操作步骤同PAP包埋前染色法的
(3)-(14)步同。
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