南方式杂交(Southern Boltting and Hybridization)
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
南方式杂交(Southern Boltting and Hybridization)
DNA片断经电泳后, 再将双股分离为单股, 然后将此单股DNA转移至nylon膜上, 经过前处理程序, 以避免杂质影响结果, 再将具有萤光标志的DNA探针与此单股DNA杂交, 之后将未结合的多馀单股DNA洗去, 再将nylon膜放入X光片卡夹中, 待曝光完全后, 将X光片冲出, 以检视结果.
材料：
欲检测之DNA(10μg左右)
电泳设备
DNA marker
直尺
0.2N HCl
nylon膜
Denaturation solution
[配方]1公升dH2O中含87.75g NaCl, 20.0g NaOH保存于室温
Naturation Solution
[配方]1.5M NaCl, 0.5M Tris.Cl pH7.2, 0.001M EDTA
20X SSC
[配方]每公升含175g NaCl, 88g Na3.Citrate.2H2O以1M HCl将pH调整至7.0
透明塑胶膜
Vaccum blotter
大张滤纸
0.4M NaOH液
SDS/Prohybridization solution
[配方]每500ml中含：
12.5ml之1M KPO4, pH7.4
125m之20X SSC
25ml之100X Denhardt`s solution
-配方-每500ml中含：
10g Ficoll 400
10g Polyvinylpyrrolidone
10g BSA保存在-20℃
或以30g脱脂牛奶粉溶于500ml dH2O中取代
5ml之5mg/ml salmon sperm DNA
250ml之100﹪formamide
82.5ml之dH2O
再加入1﹪(w/v)之SDS保存在-20℃
SDS/hybridization solution
[配方]与SDS/Prehybridization solution相似, 除不加水外, 加入50g的dxtran sulfate<分子量500,000>, 然后搅拌整夜, 第二天在水使整个体积成为500ml, 保存在-20℃.
紫外线DNA定合仪
封袋机
塑胶袋
以萤光标定之探针DNA(此一部份之製作另外说明)
X光片
X光片卡夹
暗房设备(装X光片及冲片用)
方法：
1. 先将欲检测之DNA及DNA marker依一般电泳技术执行电泳.
2. 将电泳胶取出照相(在拍照时一把直尺放在泳胶旁, 以确定各DNA片段之位置以便比较分子量).
3. 将电泳胶放入依含500ml 0.2N HCl的盘中, 缓缓摇动此盘10min.
4. 倒去HCl液, 加入dH2O清洗泳胶三次. 此时loading dye中的bromphenol blue由蓝变黄, 倒去dH2O.
5. 倒入500ml denaturation solution, 缓缓摇动盘子, 15min后, 倒去液体再重複一次, 此时bromphenol blue颜色又恢复为蓝色, 显示DNA双股以分离为单股, 倒去液体.
6. 加入500ml denaturation solution, 摇动盘子30分钟.
7. 以利剪剪下一块比泳胶各边均小3mm之nylon膜, 至一盘中含20X SSC液, 液量已能遮盖此膜为度, 5min(处理nylon膜时必须戴手套操作, 以免影响实验结果, 因此膜极为敏感).
8. 另剪一张滤纸与nylon膜同大小, 亦浸入20X SSC液中.
9. 依Vaccum blotter装置将nylon膜放在滤纸上, 再放在多孔盘上, 再放在blotter主体凹凸状平盘上, 在nylon膜上则放上软塑胶垫片, 此垫片之上放泳胶, 有孔的面向上, 泳胶底缴边均比此垫片之切割面要大至少5mm, 再盖上blotter的盖框.(若泳胶与nylon膜之间有任何气泡存在, 可以玻璃吸管平平推过泳胶面, 使气泡推出, 至完全无气泡为止).
10.打开抽器开关, 调整吸力至5 inches水银柱高.
11.在blotter盖框中倒入1,500ml之0.4M NaOH液, 检查泳胶与垫片之接合是否紧密；并检查真空吸力是否维持5 inches Hg, 做必要之调整.
12.让DNA游泳胶中转移至nylon膜上, 90分钟, 关掉开关.
13.将装置鬆开, 取出泳胶, 在紫外线下检查是否有无DNA存留.(必要时可再以1.0μg/ml浓度的ethidium bromide染色一次在检查).
14.将nylon膜取出,放在2X SSC中2分钟再取出, 此时以铅笔在nylon膜上做记号以辨认有DNA的面.
15.将nylon膜以透明胶膜包好, 有DNA的面向上, 至于紫外线DNA定合仪中照射120,000micro joules, 5min紫外线, 此时DNA已定合在膜上, 取出nylon膜.
16.将nylon膜放入封闭的塑胶袋中, 并在袋中加入10ml SDS/Prehybridization液, 至65℃, 1hr后, 剪开袋角一小口, 倒出液体.
17.将准备好的带萤光之DNA探针放小型离心管中, 在沸水中置5分钟, 再将之加入10ml之SDS/hybridization液中, 充分溷合, 再注入袋中, 再将袋角封口, 置65℃, 过夜.
18.第二天, 将袋剪开, 取出nylon膜,
先以 2X SSC/0.1﹪SDS洗 5min, 室温；
再以 2X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室温；
再以0.5X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室温；
再以0.1X SSC/0.1﹪SDS洗15min, 室温；
再以0.1X SSC/0.1﹪SDS洗30min, 65℃.
19.将nylon膜由包膜中取出, 在暗房中将nylon膜与X光片放入X光片夹中, 2天, 有DNA的面与X光片相向.
20.在暗房中, 取出X光片, 冲出, 检视结果.
在正常情况下, 在10μg的哺乳类DNA中, 可侦测出10pq(1pq＝0.1×10-12g)的DNA, 亦即一个基因的量即可测出, 因此本实验可比为由大海可捞针.
此实验中, 若所欲找的基因与探针之间的差异较大, 则杂交温度可降低些. 在杂交液中所使用的dextran sulfate目的在促使探针DNA结合于杂交处, 但对单股DNA无用, 故不必用于前处理液中.
