真核细胞的细胞核与细胞其他部分分开技术
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
分离细胞核技术
将真核细胞的细胞核与细胞其他部分分开, 以利其他实验之用.
材料：
Lysis buffer
[配方] 10mM Tris.Cl, pH7.43mM CaCl2
2mM MgCl2
Nonidet P-40(NP-40) lysis buffer B
[配方] 10mM Tris.Cl, pH7.43mM CaCl2
2mM MgCl2 1﹪NP-40
(前三项配合先高温高压消毒后, 待冷却再加入NP-40)
均质器
方法：
1. 对单层组织培养细胞, 可先到去培养液, 以5ml, 4℃ PBS清洗细胞二次, 再以高温高压消毒过之软胶刮刀将细胞刮下, 并离心1,500rpm, 5min, 4℃； 若为浮悬细胞, 则直接离心1,500rpm, 5min, 4℃, 并以4℃ PBS洗细胞二次(离心, 倒去上清), 本实验均以5×107细胞量设计.
2. 将细胞溶于15μl, 4℃, lysis buffer中, 缓缓溷合, 10min.
3. 离心4℃, 1,500rpm, 5min, 倒去上清, 再将细胞溶于1ml lysis buffer中.
4. 再加入1ml NP-40 lysis buffer B, 缓缓充分溷合.
5. 将细胞吸入均质器, 搅动10次, 取少数液置血液计数器, 在显微镜下检视细胞是否只剩细胞核.
6. 将只剩细胞核的细胞溶转入无菌离心管中, 离心1,500rpm, 4℃, 5min.
7. 仔细吸除上清, 将沉淀之细胞核置冰上, 再加入200μl之甘油保存液(配方：50mM Tris.Cl, pH8.3
40﹪ glycerol
5mM MgCl2
0.1mM EDTA),
使细胞核溶于液中, 在将之保存在-70℃中.
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