用于修饰DNA的酶与使用方法
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
用于修饰DNA的酶与使用方法
酶应保存在-20℃冷柜中, 使用时取出放在0℃冰上, 酶的价格昂贵, 宜珍惜使用.
各种酶均有其特别的缓冲液. 通常均可在採购时向厂商索取.
The Klenow fragment：是E.Coli DNA PolymeraseI靠C端的部份，为删去由NH2端的323个胺基酸而成，具有DNA Polymerase与3'→5'exonuclease的功能. 以Klenow fragment来将含萤光标定的d NTP或放射性标定的d NTP加于DNA片段尾端, 可将约0.1~4μg由电泳中提纯的DNA, 加上萤光标定的d NTP, 再加上未标定的3 d NTPs, 再加上1U的Klenow fragment, 再加入适量buffer, 置30℃, 20min即可(其中d NTP的浓度在0.5mM). 此原理是利用限制酶切割后再经电泳提纯的DNA, 在二端均有 ----____单股部分, Klenow fragment会将d NTP加于单股处, 此时需注意的是所缺的单股若正好无可配标定d NTP的核甘酸则无法标定, 故应注意. 如以Ban HI切割的会有GATC排序, 若以Eco RI切割的则会有AATT排序, 此时若以有标定的GTP或CTP来标定则无效.
亦可採用Random Oligonucleotide-Primed synthesis方法来标定DNA, 其原理为：将DNA以某一限制酶切割, 再电泳, 取出所需的DNA片段, 加热使此双股DNA分为单股, 再将Random Oligonucleotide(通常为六个nucleotides)接上去, 再放入d NTPs即Klenow frament, 如此, 则DNA片段就会被标定了.
方法：
1. 在一个小型离心管中加入2.5μl之0.5mM 3dCTPs.
2. 再加入10X之Klenow fragment buffer, 2.5μl.
3. 加入欲标定之有标定dNTP, 1μl.
4. 再加入1μl之Klenow fragment.
5. 再以另一支离心管, 加入约0.03~0.1μg的DNA(想被标定的DNA), 及Random hexanucleotide(1μg), 再加入T.E. buffer使总体机为18μl, 将此离心管置沸水中3min, 再取出放冰上.
6. 将二支离心管物溷合, 置室温, 3hr, 反应即完成.
Taq DNA Polymerase之使用：
此酶係由Thermus aquaticus菌所分离出来, 它的最有效温度是在75~80℃, 它多被用于Polymerase Chain Reaction(PCR). 其使用方法在介绍PCR时再行介绍.
RNase亦有由不同来源分离出来者, 所切割RNA的位置亦不同, 但一般RNase均能在多种反应情况下产生作用, 且使用后若要除去它, 通常要加入Proteinase K, 再以Phenol extractions及ethanol precipitation处理.
DNA ligases：
用以接合单股有缺口的DNA或双股可交叉配合的DNA(即以限制酶切割所形成的 ----____ 交叉片段. 时下使用的ligase, 要ATP, E.Coli ligase要NAD为能源.
使用方法：
1. 在微量离心管中加入ligase缓冲液,再加入0.5mM ATP, 1μg DNA(即所需接合的DNA), 再加入1μ的T4 ligase, 置15℃, 2hr, 可成.
2. 若係二段钝端DNA接合(即无交叉片段之DNA), 则需10倍以上的酶方能达成. 有研究显示加入即为量的PEG8000可助ligase的功能.
运用ligase构建嫁接DNA分子：
1. 再将想构建的DNA片段经电泳幼提纯之后, 以下法进行：
2. 取0.1至5μg想接合构建的DNA放入微量离心管中(体积以9μl为准), 再加入10μl之2X ligase buffer, 再加入1μl之10mM ATP, 再加入20至500μ的T4 DNA ligase(以有交叉配对的DNA为准).
3. 置15℃, 3hr, 或隔夜, 可成.
4. 将此接合之嫁接媒介, 以基因转植方式, 植入E.Coli宿主, 并检查结果, 依marker表现情形可知有无正确的结果, 若有, 则将含此正确嫁接媒介的E.Coli加以培养, 再以提纯质体方式获取大量所要的嫁接媒介.
2X T4 DNA ligase buffer之配方为：
100mM Tris.Cl, pH7.5
20Mm MgCl2
20Mm DTT(dithiothreitol此物必须冷冻保存)
在构建嫁接媒介时, 必须考虑到它要能在宿主中能自行複製, 且能将所要的基因表现出来, 而且还能加上marker, 以便由marker之有无来检测构建之成功与否. 在使用ligase时, 常会有各种机率的结合, 而产生非所要的结果,亦有多段结合者， 但因皆与或然率有关, 理论上仍会出现若干所要的结果.
