Yeast的嫁接媒介的方法和步骤
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
Yeast的嫁接媒介
有些yeast的嫁接媒介(cloning vector)为plasmids, 称为YRP(yeast replicating plasmids), 其中含有yeast DNA複製起始点的片段基因, 称为ARS(autonomous replication sequences), 但这种plasmids在繁殖过程中常不能保存在新的细胞中, 若在此plasmids中加入Centromeres(CEN elements), 而形成YCP(yeast centromeric plasmids), 就可使其稳定性增加.
另有YEP(yeast episomal plasmids), 是由yeast的plasmid所构成. 还有YLP(yeast linear plasmids)是直线型的, 因含有telomeres, 还有yeast artificial chromosome(p YAC), 可供嫁接约400Kb的DNA. 此plasemid并可长在E.Coli中.
在这些嫁接媒体中, 为便于检测特定基因的功能, 常在此特定基因加上Lac 2 gene, 此基因係因E.Coli中得来, 会产生β-galactosidase, 当此 遇到一些类似β-galactosides物时, 会分解之而产生有颜色的分解物, 很容易侦测. 为使此基因能在yeast中运作, 在此基因前需先加上yeast的promoter region, 以下介绍一种测β-galactosidase量的方法.
此法是基于含此基因的yeast, 长于培养液中, 加入ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactoside), 使在30℃作用, 再以滴定使pH达11终止反应, 再以光谱仪测色度变化而计算β-galactosidase的量.
材 料：
YPD培养液
Z buffer
0.1﹪sodium dodecyl sulfate (SDS)
chloroform
4mg/ml ONPG in 0.1M KPO4, pH7.0 (过滤消毒, 保存-20℃)
1M NaCO3
30℃ Water bath
方 法：
1. 以一个菌群的纯yeast接种于5ml的YPS液中, 过夜(可做二, 三个菌群以便比较).
2. 以过夜培养的yeast液50μl接种无菌的YPD液5ml, 使长至OD＝2.0(大约0.5~1×108cells/ml).
3. 离心2,500rpm, 5min, (桌上型离心机), 将沉淀物溶于等量Z buffer中. (如果β-galactosidase量不多, 可以溶于较少量的Z buffer中).
4. 由上述步骤中之yeast, 取出二个样本, 一为100μl细胞加900μl Z buffer, 另一为50μl细胞加950μl Z buffer.
5. 在每一样本中各加入1滴Chloroform及2滴0.1﹪SDS液, vortex 10sec, 再放入30℃水浴中15min.
6. 在每一样本中加入0.2ml的4mg/ml ONPG, vortex 5sec, 并于30℃水浴中, 并开始计时.
7. 发现有黄色出现时, 加入0.5ml的1M Na2CO3并记下时间.
8. 离心5min, 2,500rpm, 在测上清液的OD420与OD550(若上清液中不含细胞破裂物, 则OD550通常为0, 可以不计算).
