以Zymolase处理yeasts, 抽提酵母菌DNA的方法？
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
抽提酵母菌DNA
以下介绍以Zymolase处理yeasts, 使成为spheroplasts, 再以SDS使破裂, 再以potassium acetate将SDS, proteins及cellular debris沉淀, 而核酸则保留在上清液中, 这种方法来抽提yeast的DNA.
材 料：
YPD medium
Sorbitol solution
0.3mg/ml Zymolase (20,000U/g) in sorbitol solution
0.28M β-mercaptoethanol
Tris/EDTA solution
10﹪SDS
5M Potassium acetate
100﹪ethanol
TE buffer
1mg/ml RNase A
100﹪isopropanol
15ml 离心管(用过即弃式)
30℃及37℃振盪培养相
65℃水溶器
方 法：
1. 在15ml无菌离心管中, 培养5ml的纯yeast菌种(由单一菌群接种), 30℃, 振盪培养24hr, 350rpm, 此时细胞数约1~2×108cells/ml.
2. 离心3,000rpm, 5min, 将上清液吸除.
3. 加入0.5ml sobitol solution, 充分溷合.
4. 加入5μl的0.3mg/ml zymolase in sobitol solution, 以及50μl的0.28M β-mercaptoethanol, 充分溷合(votex), 置37℃, 1hr, 振盪200rpm.
5. 离心3,000rpm, 5min, 吸除上清, 加入0.5ml Tris/EDTA液, 将液体吸上吸下以充分溷合, 再将全部液体(即细胞浮悬液)转入1.5ml的微量离心管中.
6. 再加入50μl的10﹪SDS液, 缓缓溷合, 置65℃, 20min.
7. 再加入200μl的5M potassion acetate, 缓缓溷合, 置冰上30min.
8. 离心10,000rpm, 3min.
9. 将上清液转入另一离心管中, 再加入100﹪ethanol置离心管, 缓缓溷合. (此时DNA会出现)
10.离心10,000rpm, 10sec, 沉淀DNA, 倒除上清, 将DNA溶于300μl TE中.
11.加入50μl的1mg/ml Rnase A, 充分溷合, 置37℃, 1hr.
12.加入0.5ml的100﹪isopropanol, 缓缓溷合, 至DNA沉淀出来.
13.将DNA以微量吸管尖头取出, 并转入另一新离心管中, 加入125μl的TE buffer.
配方：
Sorbitol solution：
0.9M sorbitol
0.1M Tris,Cl, pH8.0
0.1M EDTA
Tris/EDTA solution：
50mM Tris,Cl, pH8.0
20mM EDTA
附注：
在抽提yeast DNA时, plasmids也会一同析出, 其量大约是yeast DNA量的1/1,000, 亦即在2ml的yeast cells可提出约4μg的DNA, 而其中plasmids约有4ng, 可直接用来转植. (只要用0.1μg的DNA即可, 其中约含0.1ng的plasmeds)
