体视显微镜下毛囊干细胞组织块法
最近几年，毛囊干细胞以其强大分化能力被认为是即神经干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞之后的又一真正干细胞。它来源广泛，不像其他细胞那样难以取得，因此被认为是可以大量利用的干细胞。然而毛囊干细胞的分离却成为其中的一大难题。
对毛囊干细胞的分离培养进行讨论。 使其规范，以后手术时就轻松自如的调整焦点。
我们实验室培养大鼠触须的毛囊干细胞一般用组织块法，也有用消化法的，组织块法一般是在体视显微镜下将毛囊先从组织中分出，然后消化，将真皮鞘剥掉，分离出完整的毛囊，但要主要bulge区一定保持完整，然后接种培养，一般都能养的出来．

手术显微镜的调整:
使用手术显微镜前需对手术显微镜进行调节，使其在手术过程中始终处于最佳工作
状态。应形成程序化，其具体步骤如下：
1. 0位调整即将X-Y轴及聚焦微调系统均调整到0位。先将X-Y轴0位调整按钮，使显微镜自动运行到中心起始位置，使术中通过X-Y轴系统调整时，镜头向各方向移动有充分的余地。然后将聚焦微调系统调至0位，这样可以使术中聚焦微调有足够的升降调节范围。
2.调节目镜的屈光度以矫正术者的屈光不正，如无屈光不正，目镜应在0位，需
双眼分别进行调整。若屈光不正大于5D或有散光时，术者应戴矫正眼镜。用低倍镜聚焦于虹膜表面或角膜缘附近小血管，至看得非常清晰为止。术者调整后，在同一条件下助手按同样步骤调整目镜的屈光度，也能看清同一目标。
3.调整瞳孔距离双眼同时观察画面，若其中一侧不在视野中心，应调整瞳孔距
离旋扭，直至获得双眼立体视觉效果。
4.调到高倍镜，如200×，反复聚焦调节，直到能清晰看到虹膜纹理，且瞳孔在中
心位置。然后再调回到低倍镜，备用。
5.进行白内障摘出人工晶状体植入手术时，应注意调整显微镜物镜的倾斜度及患
者的头位，使目镜平面与患者术眼的平面基本平行，以产生良好的红光反射。
6.倍率调节放大倍率是手术显微镜的一个重要参数，放大倍数不同，可见视场直径大小及景深也不同。放大倍率越小，视野所及范围越大，反之放大倍率高，则视野范围小。4×放大倍率，视场可包括所有眼睑、上及眉弓下到颧突，即视场直径约为50mm；8×视场可包括内外眦部，约’30mm直径范围；10×视场可包括整个眼球，即开睑时所有结膜暴露部分，约22mm直径范围；20×视场恰好包括整个角膜,约11mm直径范围；而25×视场仅包括虹膜中周部以内，约7mm直径范围。对以上不同倍率所及范围应有明确概念，以便在手术中根据手术部位和操作步骤作随意调整。
在手术显微镜的应用中，放大倍率越高，视野越窄，景深越小，操作也越困难。特
别是对初学者，高倍率下常感困难。一般而言，低倍镜下不适于涉及范围大或动作幅度较大的操作，如剪开结膜结扎缝线等用4×-6×比较合适，而一些精细操作如截囊、小梁切除，用10×-12×较为安全，作小梁切开辨认sehlemm管时可用20×-25×。
7.如有教学镜及摄像录像设备，手术前同样进行同步视度调整，以取得最佳示教
效果。
8.术中调整显微镜
（1）在不同层次操作时，应及时调整显微镜的焦距，使焦点准确地落在正进行手术操作的组织上，使手术始终在最清晰的情况下进行。
（2）根据手术组织的大小不同，及时调整显微镜的放大倍率。
（3）根据手术需要调节显微镜的倾斜度，如冲吸晶状体皮质时，为获得最佳的红光反射，应将显微镜的光线垂直射入眼底，不需要红光反射下操作时，应及时改变显微镜的倾斜度，避免显微镜垂直射入眼底而损伤黄斑。
我觉得分离大鼠胡须的毛囊来培养还是比较容易的，但我不能确定养不出来的细胞是不是毛囊干细胞
讨论：
因为不知道你想分离的是哪种细胞，是内皮还是黑色素还是提到的新的干细胞，文中的分离步骤可大致总结为
1 采集人头皮组织(0.5 X 2cm2 ),洗净，切断，去除多余脂肪组织
2 酶消化24h in 4C(dispase in DMEM Invitrogen)使上皮从真皮层脱落‘
3 把毛囊从真皮层剥离出来，用PBS洗涤，完全去除真皮和上皮的污染
4 0.25% Trypsin/EDTA消化37C 30min
5 40um BD strainer过滤 接种
6 培基条件 标准ES培基（80% KO DMEM 20%FBS 200mM Glutamine,0.1 Beta-巯，1% Non-AA, 4ng/ml bFGF)先与MEF培养48h，收集条件培养液后与新鲜ES培基3:1混合，过滤，再加4ng/ml bFGF)

在上面的原代培养中，用ES培基即能诱导毛囊干细胞的出现（human follicle stem cell),接下来的单克隆实验（极限稀释法）表明毛囊干细胞的自我增殖特点，并能重新形成hair sphere,这些毛囊干细胞不表达常规的黑色素干细胞标记MITF和TRYP1,神经元的MAP2和b微管蛋白，平滑肌中的calponin and desmin，还有角质细胞的角蛋白等，但表达Oct-4和nanog.但有说服力是，在后续的诱导条件下，这些不再表达的基因又重新出现，没有诱导则不出现。推广到我们目前研究的多的MSC，成体干细胞真的也具有多能性吗？是一种转分化机制（受周围环境诱导的直接谱系转化）还是一种先去分化再分化的途径？我记得以前在nature上看到一篇关于果蝇生殖干细胞的研究中，在28C分化，回到19C后，分化的干细胞又变成了干细胞，说明环境因素也能参与干细胞的动态调控，现在的情况是越来越不清楚了。当然这篇文章只是提到了新发现的一种干细胞，从描述上看似乎比成体干细胞更幼稚（有更强的分化能力），介于于ES-Adult stem cell之间，或者是一种更原始的前体细胞，又或者是已证明存在的黑色素和内皮干细胞的干细胞池，究竟干细胞的发现要外延多远，拭目以待。