体外细胞夹层培养法的详细做法

光镜:在倒置相差显微镜下观察到用交替循环灌注肝脏制备的肝细胞悬液中含有许多单个细胞及少量细胞团,活肝细胞呈透亮,具有立体感的球形,圆形细胞.细胞边界轮廓清晰,细胞核位于细胞正中.各组3小时平均贴壁细胞量分别为:A组37%,B组63%,C组62.8%,D组63.6%.培养24小时后可见各组细胞充分贴附,伸展,呈圆形,椭圆形及多边形.培养36小时后,附壁生长的肝细胞的形态改变更加明显,肝细胞拉平,伸展,呈纺锤形,三角形或不规则多角形等多种形态粘附于培养面上.培养48小时后,整个肝细胞变得更薄,绝大部分的肝细胞拉平,延伸,呈现"拉网"(netting)现象,在倒置相差显微镜下紧紧贴附于培养面上.细胞边界轮廓清晰可见,细胞核体积较大,其中可见较多的双核肝细胞,细胞浆为颗粒状.培养2-3天后,肝细胞开始增殖,在原有肝细胞周围出现非常透明的,体积较小的上皮样细胞.培养4-5天后,新增生的肝细胞增多,肝细胞与肝细胞呈多种形式的连接,集落生长,融合成片.虽然各培养体系中肝细胞的生存时间长短不同,但死亡前均有以下特点:肝细胞形态开始变为不规则形,胞浆内可见明显的颗粒,并有空泡形成,细胞边缘不清,渐渐细胞脱离微载体,细胞核消失最后脱落死亡.细胞培养过程中未见纤维母细胞生长,也无细菌及真菌污染.
2.1.2电镜:四组短期原代培养的肝细胞具有正常肝细胞的超微结构,表现为细胞膜及核膜完整,肝细胞膜上有大量的微绒毛,细胞间有特征性的紧密连接以及毛细胆管.胞质均匀一致,胞浆内有较丰富的细胞器:如呈杆状或卵圆形数量较多的线粒体,玫瑰花瓣形糖原颗粒,大量的内质网,包括粗面内质网和滑面内质网以及高尔基复合体,溶酶体,过氧化物酶等 .
2.2细胞培养液中LDH活性测定:分别取不同培养时间点的各组肝细胞培养液上清,LDH试剂法全自动生化分析仪测定培养上清中LDH含量.
2.3各组培养体系对肝细胞贴壁速度及贴壁量的影响:分别取不同培养时间点的肝细胞,经胰蛋白酶和EDTA混合