最全面的显微镜细胞消化法（传代培养）操作指南
一. 事前准备：
1.使用显微镜前用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
2.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
3.正确摆放使用的器械，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯，注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭光学显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
9稍微摇摇，然后从对侧倒掉培养液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精灯。
二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，然后让其停止消化。
3.倒掉消化液加入培养液，弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液。注意要在对测加入培养液。
三.吹打分散细胞：
1.吹打制悬：在显微镜用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心5分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四.分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml，最后要做好标记。
五.传代培养：
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
六传代细胞培养注意事项：
1.严格的无菌操作
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)
配方：100ml PBS,0.25g胰酶
步骤：
1先配100mlPBS。
2 称胰酶0.25g。
3 加入PBS中，低速搅拌。
4 调PH7.4。
5 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完。
注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难消化的细胞，在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)